Анализируемые образцы хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 7 суток или при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Замороженные образцы перед исследованием следует разморозить и тщательно перемешать встряхиванием. Повторное замораживание не допускается.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ).
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с моноспецифическими сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ± 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застыва¬ния агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.
Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп, а после проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара заполнить их с помощью пипеточного дозатора нормальной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенные моноспецифические сыворотки против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов человека. Пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации.
Учет результатов проводить визуально. Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б.
Типирование белков Бенс-Джонса проводить в ИЭФ с сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов: с одной сывороткой образуется четкая линия преципитации, а с другой сывороткой линии преципитации не образуются.
а.
б.
Типирование белка Бенс-Джонса.
В лунках – раствор белка Бенс-Джонса, в канавках: а – сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов, б – сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов.
Типирование миеломных иммуноглобулинов следует проводить в ИЭФ с сыворотками против κ- и λ-цепей иммуноглобулинов и с моноспецифическими сыворотками против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) человека.
Ig-миелома определяется по образованию линии преципитации с характерной миеломной конфигурацией (утолщение в определенном участке линии) с одной из сывороток против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) и аналогичной по форме линии с одной из сывороток против κ- или λ-цепи.
а.
б.
в.
Типирование Ig-миеломы.
В лунках – исследуемая сыворотка крови человека, в канавках: а – сыворотка против κ-цепей иммуноглобулинов, б – сыворотка против λ-цепей иммуноглобулинов, в – сыворотка против IgG(H).
При не выявлении линий преципитации миеломной конфигурации с сыворотками против IgG(H), IgА(H), IgМ(H) рекомендуется провести в образцах количественное определение IgD и IgE.
Реакция преципитации в геле (по Оухтерлони).
Приготовление агарового геля 1 %.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 100 мл воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлорида, 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90±120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания на агаре с помощью специального штампа вырезать лунки и удалить из них агар.
В центральную лунку внести с помощью пипеточного дозатора растворенную моноспецифическую сыворотку, а в лунки, расположенные по окружности – анализируемые образцы (моча миеломных больных, растворы, выделенных из нее белков Бенс-Джонса).
После внесения образцов пластины поместить во влажную камеру и выдержать при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле между лунками при наличии соответствующих антигенов и антител образуются линии преципитации.
Если анализируемый образец образует линию преципитации с сывороткой против κ-цепи и не образует ее с сывороткой против λ-цепи, то в ней присутствует белок Бенс-Джонса κ-типа. При противоположном результате – в анализируемом образце присутствует белок Бенс-Джонса λ-типа.
Радиальная иммунодиффузия (РИД) (по Манчини).
Принцип метода заключается в том, что антиген, внесенный в лунки агарового геля, содержащего моноспецифическую сыворотку к этому антигену, диффундирует в гель и, взаимодействуя с антителами сыворотки, образует кольцо преципитации. После инкубации устанавливается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и диаметром кольца преципитации в определенном диапазоне концентраций.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерный стакан на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.
Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 2 %.
2 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и затем варить на кипящей водяной бане в 0,1 л воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлористого, затем 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Агаровый гель разлить в пробирки по 6-8 мл, три из которых поставить в водяную баню с температурой (53±3) °С.
Приготовить последовательные разведения контрольной сыворотки крови человека натрия хлорида раствором 0,9 % в 2 и 4 раза.
На обезжиренную стеклянную пластину, покрытую тонкой агаровой пленкой, поместить П-образную рамку, накрыть второй пластиной, смазанной гидрофобной жидкостью, и скрепить зажимами.
Растворенные моноспецифические сыворотки развести натрия хлорида раствором 0,9 % до концентрации, в два раза превышающий титр, указанный на ампуле (например, при указанном титре 1 : 10 сыворотку следует развести в 5 раз), чтобы потом при смешивании в равных количествах с растопленным агаровым гелем получилось заявленное разведение.
Пробирки с разведенными сыворотками промаркировать и поставить для прогрева в водяную баню с температурой (53±3) °С в течение 20-30 мин.
Агаровый гель 2 % тщательно смешать с равным объемом разведенной моноспецифической сыворотки. Полученную смесь с помощью стеклянной пипетки залить в пространство между стеклянными пластинами. Пластины промаркировать по содержащейся в агаре сыворотке и поместить на 15-20 мин.
Таким образом приготовить пластину и для второй сыворотки.
После застывания агара снять зажимы, верхнее стекло и рамку. В слое агара прорезать пробойником несколько рядов лунок диаметром 2-3 мм на расстоянии 15 мм от другого и агар из них удалить.
С помощью микрошприца внести в лунки по 2 мкл нормальную сыворотку крови человека (неразведенную и в разведениях в 2 и 4 раза) и анализируемые образцы.
Затем пластины поместить во влажную камеру и инкубировать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле образуются кольца преципитации.
Во многих случаях измерять диаметры колец преципитации можно на влажном агаровом геле. Измерение проводить с помощью окулярного микрометра, который прикладывают к обратной стороне пластин.
Пластины также можно окрашивать. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.
На высушенных пластинах измерять диаметры колец преципитации с помощью специальной линейки (например, линейки «Берингверке») с точностью до 0,1 мм.
Концентрацию иммуноглобулинов κ- и λ-типа (в процентах) определяют по калибровочной кривой, выражающей зависимость между уровнем иммуноглобулинов определенного типа и диаметром колец преципитации (для данной пластины). Для построения калибровочных кривых используют полулогарифмическую бумагу, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулинов κ- или λ-типа в нормальной сыворотке (неразведенная сыворотка – 100 %), а на оси абсцисс – величины диаметров колец преципитации (в мм). Образовавшиеся точки соединяют прямой линией. Таким образом строят графики для иммуноглобулинов κ- или λ-типа в отдельности. Во избежание ошибок наклон этой линии желательно иметь 40°-50°. Зная диаметр колец в исследуемых препаратах, полученных на этой же пластине, по калибровочной линии определяют концентрацию в них иммуноглобулинов данного типа в процентах.
В случае, когда диаметр кольца преципитации исследуемого образца превышает значение диаметра кольца преципитации в неразведенной нормальной сыворотке крови человека, образец следует развести натрия хлорида раствором 0,9 % и повторить определение. Полученный результат умножить на величину разведения.
Для оценки уровня иммуноглобулинов κ- и λ-типов в норме и патологии существенным является не их абсолютный уровень, а соотношение κ / λ, которое в норме является величиной стабильной и изменяется лишь при некоторых патологиях.
Соотношение полученных значений в процентах для сывороток здоровых людей находится в диапазоне индивидуальной вариабельности 1,0 ± 0,25.
Определение абсолютного уровня иммуноглобулинов κ- и λ-типов можно проводить лишь по отношению к стандартному образцу с известным содержанием иммуноглобулинов κ- и λ-типа.
Среднее содержание иммуноглобулинов κ-типа в норме составляет 9,75 мг/мл, а иммуноглобулинов λ-типа – 5,0 мг/мг, а их соотношение находится в диапазоне от 1,8 до 2,0 («Иммунохимическая диагностика гаммапатий. Методические рекомендации», М., 1984).
