Лабораторное исследование проводится по клиническим и эпидемиологическим показаниям. В качестве анализируемых образцов используют образцы сыворотки крови человека.
Анализируемый образец хранят в условиях, предотвращающих бактериальный пророст при температуре от 2 до 8 оС не более 24 ч. Допускается замораживание анализируемых образцов, перед исследованием их размораживают при комнатной температуре.
Парные сыворотки должны исследоваться одномоментно (независимо от результатов первого исследования), для этого первая сыворотка до исследования должна храниться в замороженном виде.
Анализ образцов с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания или повторно замораживаемых не допускается.
Для проведения РНГА истощения и инактивации исследуемых сывороток не требуется. Все исследуемые образцы должны быть идентифицированы (промаркированы).
Подготовка компонентов и растворов для РНГА
Приготовление нейтрального формалина: к 1 кг формалина добавляют 0,5 кг кальция углекислого, тщательно перемешивают, выдерживают в темном месте при комнатной температуре не менее трех суток. Перед использованием необходимый объем сливают с осадка и отфильтровывают через бумажный фильтр.
Приготовление формалинизированного фосфатно-солевого буферного раствора рН (7,0-7,4).
8,6 г натрия хлорида, 0,56 г динатрия гидрофосфата, предварительно высушенного до постоянной массы, 0,084 г калия дигидрофосфата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, добавляют 800 мл воды очищенной или воды дистиллированной, перемешивают до полного растворения, доводят водой очищенной объем раствора до метки. К полученному раствору добавляют 0,3% раствора нейтрального формалина.
Перед использованием все реагенты выдержать при температуре от 15 до 25 °С не менее 30 мин.
Содержимое ампулы с сывороткой диагностической к риккетсиям Провачека для РНГА сухой восстанавливают в 1 мл формалинизированного фосфатно-солевого буферного раствора (рН 7,0-7,4), получая разведение 1:10.
Флаконы с диагностикумом и эритроцитами человека непосредственно перед использованием интенсивно встряхивают до полной гомогенизации содержимого. После этого флаконы вскрывают. В ходе работы встряхивание рекомендуется повторять.
Вскрытые флаконы с диагностикумом и эритроцитами человека формалинизированными, несенсибилизированными можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 месяца во флаконах, закрытых резиновыми пробками.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
При проведении анализа и интерпретации результатов следует учитывать Приказ МЗ РФ от 26 ноября 1998 г. №342 «Об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом».
Проведение РНГА.
Разведение ингредиентов реакции готовят с использованием формалинизированного фосфатно-солевого буферного раствора.
В горизонтальном ряду лунок пластины полистироловой 72-луночной готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки, начиная с 1:125, и заканчивая 1:64000 в объеме 0,4 мл. В каждую лунку пластины, содержащую разведения сыворотки, добавляют по 0,1 мл диагностикума.
Реакцию сопровождают следующими контролями:
1. Контроль всех задействованных в опыте сывороток на отсутствие неспецифических
гемагглютининов: в трех лунках пластины полистироловой готовят последовательные двукратные разведения каждой сыворотки, начиная с 1:125, и заканчивая 1:500 в объеме 0,4 мл. Затем в каждую лунку добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов человека формалинизированных несенсибилизированных жидких;
2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной
агглютинации: в 2 лунки пластины полистироловой наливают по 0,4 мл формалинизированного фосфатно-солевого буферного раствора и добавляют в каждую лунку по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума;
3. Контроль эритроцитов человека формалинизированных несенсибилизированных
жидких на отсутствие спонтанной агглютинации: в 2 лунки пластины полистироловой наливают по 0,4 мл формалинизированного фосфатно-солевого буферного раствора и добавляют в каждую лунку пo 0,1 мл взвеси эритроцитов формалинизированных несенсибилизированных.
4. Контроль диагностической сыворотки на соответствие заявленному титру. Для этого: в горизонтальном ряду лунок пластины полистироловой готовят последовательные двукратные разведения сыворотки диагностической, начиная с 1:125, и заканчивая 1:64000 в объёме 0,4 мл. В каждую лунку пластины полистироловой, содержащую разведения сыворотки, приливают по 0,1 мл диагностикума.
Содержимое лунок перемешивают интенсивным покачиванием пластины до получения гомогенной взвеси эритроцитов и оставляют при температуре 15-25°С.
РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учет результатов реакции проводят через 16–20 ч, определяя наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов (предварительный учет результатов возможен через 3–4 ч).
Реакцию считают положительной (оценивают на «+»), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол (зонтик).
Реакцию считают отрицательной (оценивают на «-«) при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем.
Примечание
В первых лунках планшета может наблюдаться «феномен» сползания агглютинированных эритроцитов с образованием по краю лунки кольца с неровным краем (эффект «свертывания зонтика»).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты исследования считаются достоверными, если: в контролях 1, 2 и 3 наблюдается полное отсутствие гемагглютинации (отрицательный результат РНГА); в контроле 4 наблюдается агглютинация диагностикума сывороткой диагностической к риккетсиям Провачека для РНГА (положительный результат РНГА) до ее титра, указанного на этикетке ампулы.
При заболевании сыпным тифом специфические гемагглютинины выявляются в сыворотках крови больных начиная с 5-7дня болезни в титрах 1:125 - 1:250. Максимального уровня (1:1000 - 1:64000) титры антител в РНГА достигают в течение
первых двух недель заболевания. В связи с этим рекомендуется исследовать парные сыворотки, полученные на 5 - 7 и на 12 - 15 дни заболевания.
Диагностическим титром является положительный результат РНГА в разведении сыворотки 1:1000 и выше.
Необходима комплексная оценка результатов серологического исследования сыворотки крови с учетом клинико-эпидемиологических особенностей каждого конкретного случая (МУ 3.4.3008-12 «3.4. Санитарная охрана территории. Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней. Методические указания»).
Потенциальный риск применения набора – класс 2 б.
Медицинское изделие является безопасным при транспортировании, хранении и применении и не приносит вреда окружающей природной среде и здоровью человека
Компоненты изделия не содержат неинактивированного биологического материала. Диагностикум эритроцитарный сыпнотифозный для РНГА жидкий (ЖЭСД), Эритроциты человека формалинизированные несенсибилизированные жидкие (ЭФН) обработаны формалином и содержат формалин в субтоксичных концентрациях в качестве консерванта. Следует избегать контакта компонентов с кожей и слизистыми, а при попадании на них незамедлительно промыть большим количеством воды.
Сыворотки крови кроликов/лошадей, используемые для производства, получены от животных, прошедших ветеринарный контроль и находящихся под ветеринарным наблюдением.
Исследуемые материалы, а также сточные растворы, оборудование и материалы, находящиеся в контакте с биологическими образцами, представляют собой потенциально инфекционный материал, при работе с которым необходимо соблюдать требования:
- ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности»;
- СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I – II групп патогенности (опасности)», раздел «Риккетсии».
Необходимо:
- работать в боксированных помещениях для проведения микробиологических исследований с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды и одноразовых резиновых перчаток);
- не пипетировать ртом;
- в случае пролива образцов и рабочих растворов на рабочие поверхности, необходимо проводить дезинфекционную обработку с использованием 6 % перекиси водорода или дезинфицирующих средств, эффективность которых подтверждена в отношении используемого в работе возбудителя;
- инструменты и оборудование (до и после работы) подвергать обработке с использованием 70 % этилового спирта или дезинфицирующих средств, эффективность которых подтверждена в отношении используемого в работе возбудителя;
- утилизировать все использованные материалы, а также их растворы, исследуемые образцы и их растворы в соответствии с действующими санитарными правилами работы с патогенными микроорганизмами.
