Перед постановкой реакции определяют рабочее разведение комплемента и рассчитывают его необходимое количество.
- Определение рабочей дозы комплемента
- Титрование комплемента для основного опыта осуществляют непосредственно перед его использованием.
- Готовят рабочее разведение гемолитической сыворотки, соответствующее утроенному ее титру. Например, при титре 1:1200 к 0,1 мл гемолитической сыворотки добавляют 39,9 мл натрия хлорида раствора 0,9 % (разведение 1:400).
- Готовят гемолитическую систему: смешивают равные объемы 3 % взвеси эритроцитов барана и рабочего разведения гемолитической сыворотки. Гемолитическую систему выдерживают при температуре (36-38) ºС в течение (28-32) мин.
- Готовят разведение комплемента 1:10 в натрия хлорида растворе 0,9 %. Для этого содержимое ампулы растворяют в 10 мл натрия хлорида раствора 0,9 %.
- В ряд из 10 пробирок микропипеткой отмеряют от 0,01 до 0,1 мл комплемента, разве-денного 1:10.
- Доводят объём в каждой пробирке натрия хлорида раствором 0,9 % до 0,6 мл.
- В каждую пробирку добавляют по 0,4 мл гемолитической системы.
- Перемешивают содержимое пробирок встряхиванием до получения гомогенной взвеси эритроцитов. Пробирки выдерживают в термостате при температуре (36-38) ºС в течение (28-32) мин.
- Результаты реакции учитывают сразу после выдержки и обозначают крестами: ++++ - отсутствие гемолиза: жидкость над осадком эритроцитов не окрашена; +++ - следы гемолиза: жидкость над осадком эритроцитов слегка окрашена в розовый цвет; ++ - ясный гемолиз: жидкость над осадком красноватого цвета, значительный осадок на дне пробирки; + - почти полный гемолиз: жидкость красного цвета, незначительный осадок эритроцитов; – - полный гемолиз: жидкость красного «лакового» цвета, осадка на дне пробирки нет.
За одну единицу комплемента принимают его количество, содержащееся во второй пробирке с полным гемолизом (в данном случае 0,07 мл комплемента в разведении 1:10, что соответствует 0,007 мл неразведённого комплемента).
РСК проводят как при температуре 2–8 ºС в течение 18–20 ч («холодное» связывание), так и при температуре 36–38 ºС в течение 55–65 мин («горячее» связывание).
Рабочая доза комплемента при «холодном» связывании составляет две единицы, при «горячем» связывании – одну единицу комплемента.
- Расчет необходимого количества комплемента.
Реакцию ставят в общем объёме 1 мл:
- 0,2 мл разведенной исследуемой сыворотки;
- 0,2 мл диагностикума в рабочем разведении;
- 0,2 мл комплемента в рабочем разведении;
- 0,4 мл гемолитической системы.
Пример расчёта необходимого количества комплемента для постановки реакции методом «холодного» связывания: в приведённом выше примере 2 единицы комплемента соответствуют 0,007 мл × 2 = 0,014 мл неразведенного комплемента. Для постановки реакции на 100 пробирках необходимо взять 0,014 мл × 100 = 1,4 мл неразведенного комплемента. При этом количество натрия хлорида раствора 0,9 %, которое должно быть добавлено к данному объему комплемента, составит 0,2 мл × 100 – 1,4 мл =18,6 мл. Таким образом, общий объем комплемента в рабочем раз-ведении на 100 пробирок реакции составит 20 мл.
Для постановки реакции методом «горячего» связывания на 100 пробирках необходимо взять 0,007 мл × 100 = 0,7 мл неразведенного комплемента и развести его в 19,3 мл натрия хлорида раствора 0,9 %.
- Постановка РСК для серологической диагностики эндемического сыпного тифа.
- Содержимое ампулы с диагностикумом растворяют в натрия хлориде растворе 0,9 % в объеме, указанном на этикетке ампулы.
- В пробирках готовят последовательные двукратные разведения от 1:10 до 1:1280 исследуемых инактивированных сывороток на натрия хлориде растворе 0,9 % в объеме 0,2 мл.
- В каждую пробирку с сывороткой добавляют по 0,2 мл диагностикума в рабочем разведении.
- В каждую пробирку добавляют 0,2 мл комплемента в рабочем разведении.
- Реакцию сопровождают следующим контролем:
- Контроль соответствия заявленного титра диагностической сыворотки, выпускаемой в комплекте с диагностикумом. Содержимое ампулы регидратируют в 1 мл натрия хлорида раство-ра 0,9%, получая разведение сыворотки 1:10. В пробирках готовят последовательные двукратные разведения сыворотки от 1:10 до 1:320 (при титре 1:160) или от 1:10 до 1:640 (при титре 1:320) в объеме 0,2 мл. В каждую пробирку с разведениями диагностической сыворотки добавляют 0,2 мл диагностикума в рабочем разведении и 0,2 мл комплемента в рабочей дозе.
- Контроль исследуемых и диагностической сывороток на антикомплементарность: к 0,2 мл минимального разведения (1:10) каждой сыворотки добавляют по 0,2 мл натрия хлорида раствора 0,9 % и по 0,2 мл комплемента в рабочем разведении.
- Контроль диагностикума на антикомплементарность: к 0,2 мл диагностикума в рабо-чем разведении добавляют 0,2 мл натрия хлорида раствора 0,9 % и 0,2 мл комплемента в рабочем разведении.
- Контроль правильности рабочей дозы комплемента: в три пробирки вносят 0,2 мл, 0,1 мл и 0,05 мл комплемента в рабочем разведении и 0,4 мл, 0,5 мл и 0,55 мл натрия хлорида раствора 0,9 %соответственно.
- Контроль гемолитической системы: в пробирку наливают 0,6 мл натрия хлорида раствора 0,9 %.
- Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и выдерживают при температуре 2–8 ºС в течение 18–20 ч («холодное» связывание) или при температуре 36–38 ºС в течение 55–65 мин («горячее» связывание), после чего в каждую пробирку добавляют 0,4 мл гемолитиче-ской системы, предварительно прогретой в течение 28–32 мин при температуре 36–38 °С. Содержимое пробирок снова перемешивают встряхиванием и выдерживают при температуре 36–38 ºС в течение 20-30 мин, ориентируясь на завершение реакции в пробирках контроля рабочей дозы комплемента: в первых двух пробирках должен быть полный гемолиз (–), в третьей пробирке – задержка гемолиза не менее чем на +++.
