Набор состоит из 4 компонентов.
|
Компоненты |
Описание |
Количество |
|
Сыворотка против IgG(H) |
Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. |
3 ампулы (флакона) по 1 мл |
|
Сыворотка против IgA(H) |
Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. |
3 ампулы (флакона) по 1 мл |
|
Сыворотка против IgM(H) |
Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. |
3 ампулы (флакона) по 1 мл |
|
Контрольная сыворотка крови человека |
Пористая масса от беловато-серого до розовато-желтого цвета. |
1 ампула (флакон), 1 мл |
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ).
Метод ИЭФ основан на способности заряженных частиц перемещаться в агаровом геле под действием электрического поля и на специфической преципитации этих частиц соответствующими иммунными сыворотками с образованием видимых иммунных комплексов.
Вскрыть ампулы (флаконы) с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов G, A и М человека и контрольной сывороткой крови человека и растворить содержимое каждой в 1,0 мл воды очищенной.
Приготовление буферных растворов.
Веронал-мединаловый буферный раствор 0,05 М рН 8,6±0,1 (веронал – 1,38 г, мединал – 8,76 г, вода очищенная до 1 л);
Боратный буферный раствор, 0,05 М, рН 8,6±0,1 (борная кислота – 6,7 г, натрий тетраборнокислый 10-водный – 13,4 г, вода очищенная – до 1 л).
Использовать любой из приведенных буферных растворов.
Перед заливкой буферного раствора в электродные камеры прибора для ИЭФ, его следует развести водой очищенной в 2 раза.
Приготовление агарового геля 1 % на буферном растворе.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 50 мл воды очищенной до полного растворения. Сваренный агар перенести в мерный цилиндр объемом 100 мл и довести уровень содержимого до метки подогретым буферным раствором. Внести 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ´ 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара пластины установить в приборе для ИЭФ. Агаровый гель на пластинах соединить с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью фильтровальной бумаги, сложенной в 5-6 слоев.
Соединение агара на пластинах с буферным раствором возможно и с помощью агаровых мостиков.
Проведение ИЭФ.
В слое агара пробить лунки, используя для этого специальный штамп. После проведения электрофореза вырезать поперечные канавки.
После удаления из лунок агара, заполнить их с помощью пипеточного дозатора растворенной контрольной сывороткой крови человека и анализируемыми образцами. В одну из лунок внести краситель пиронин Б (для контроля продвижения фракций).
Прибор для ИЭФ накрыть крышкой с платиновыми электродами и подсоединить к выпрямителю электрического тока. Электрофорез проводить при напряжении 70-150 В и силе тока 10-50 мА в течение 2-3 ч. Процесс электрофореза остановить, когда пятно пиронина, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки.
После проведения электрофореза извлечь пластины из прибора. Внести в канавки растворенные моноспецифические сыворотки. Пластины поместить во влажную камеру и инкубировать при температуре (5±3) °С в течение 24-48 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле образуются линии преципитации, характерные для каждого конкретного иммуноглобулина (IgG, IgA, IgM) (Рис. 2).
Учет результатов проводить визуально. Пластины можно фотографировать контактным методом или в проходящем свете или высушивать и окрашивать раствором амидо черного 10 Б.
В лунках – контрольная сыворотка крови человека, в канавках – соответствующая моноспецифическая сыворотка.
Реакция преципитации в геле (по Оухтерлони).
Приготовление агарового геля 1 %.
Количество агарового геля должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластин. 1 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и варить на кипящей водяной бане в 100 мл воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлорида, 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Заливка стеклянных пластин агаровым гелем.
На уравновешенный с помощью уровня предметный столик установить стеклянные пластины (90 ´ 120) мм. Расплавленный и охлажденный до температуры (55±5) °С агар осторожно нанести на стеклянные пластины из расчета 20 мл расплавленного агара на пластину. После застывания агара с помощью специального штампа вырезать лунки и удалить из них агар.
В центральную лунку внести с помощью пипеточного дозатора растворенную моноспецифическую сыворотку, а в лунки, расположенные по окружности – анализируемые образцы.
Реакцию преципитации можно использовать для полуколичественного определения титра антигена. Для этого следует приготовить серию последовательных двукратных разведений исследуемого образца, используя натрия хлорида раствора 0,9%, и внести их в лунки, расположенные по окружности. Центральную лунку заполнить растворенной моноспецифической сывороткой.
После внесения сывороток пластины поместить во влажную камеру и инкубировать в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 24 ч.
Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле между лунками при наличии соответствующих антигенов и антител образуются линии преципитации.
При полуколичественном определении наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата, дает значение титра.
Радиальная иммунодиффузия (РИД) (по Манчини).
Метод РИД основан на том, что антиген, внесенный в лунки агарового геля, содержащего моноспецифическую сыворотку к этому антигену, диффундирует в гель и, взаимодействуя с антителами, образует кольцо преципитации. После инкубации устанавливается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и диаметром кольца преципитации в определенном диапазоне концентраций. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно контрольной сыворотки крови человека с известными концентрациями иммуноглобулинов, указанными на этикетке пачки.
Приготовление натрия хлорида раствора 0,9 %.
9 г натрия хлорида перенести в мерный стакан на 1 л, налить воду очищенную до метки и перемешать до полного растворения.
Приготовление красящего раствора.
1 г амидо черного 10 Б перенести в мерную колбу вместимостью 1 л, налить небольшое количество воды очищенной, прилить 70 мл кислоты уксусной, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление раствора для отмывки агара после окрашивания.
В мерную колбу вместимостью 1 л налить 25 мл кислоты уксусной, добавить 20 мл глицерина, довести объем водой очищенной до метки и перемешать.
Приготовление агарового геля 2 %.
2 г агара перенести в стакан, 2-3 раза промыть водой очищенной и затем варить на кипящей водяной бане в 0,1 л воды очищенной до полного растворения агара. В сваренный агар внести 0,9 г натрия хлорида, затем 0,1 г мертиолята и перемешать. Агаровый гель должен быть однороден, прозрачен и не должен содержать механических примесей.
Агаровый гель разлить в пробирки по 6-8 мл, три из которых поставить в водяную баню с температурой (53±3) °С. Неиспользованные пробирки можно хранить в холодильнике до следующих постановок РИД в течение 2 мес.
Приготовить последовательные разведения контрольной сыворотки крови человека натрия хлорида раствором 0,9 % в 2, 4 и 8 раз.
На обезжиренную стеклянную пластину, покрытую тонкой агаровой пленкой, поместить П-образную рамку, накрыть второй пластиной, смазанной гидрофобной жидкостью, и скрепить зажимами.
Растворенные моноспецифические сыворотки против иммуногло-булинов G, A и М человека в пробирках развести натрия хлорида раствором 0,9 % до концентрации в 2 раза превышающей титр, указанный на ампуле (например, при указанном титре 1 : 30 сыворотку следует развести в 15 раз), чтобы потом при смешивании в равных количествах с растопленным агаровым гелем получилось заявленное разведение.
Пробирки с разведенными сыворотками промаркировать и поставить для прогрева в водяную баню с температурой (53±3) °С в течение 20-30 мин.
Агаровый гель 2 % тщательно смешать с равным объемом разведенной моноспецифической сыворотки. Полученную смесь с помощью стеклянной пипетки залить в пространство между стеклянными пластинами. Пластины промаркировать по содержащейся в агаре сыворотке и поместить на 15-20 мин в холодильник.
Таким образом приготовить пластины на каждый иммуноглобулин отдельно.
После застывания агара снять зажимы, верхнее стекло, рамку и в слое агара прорезать пробойником несколько рядов лунок диаметром 2-3 мм на расстоянии 15 мм один от другого.
После удаления из лунок агара в лунки первого ряда с помощью микрошприца внести контрольную сыворотку: неразведенную и в разведениях в 2, 4 и 8 раз. Лунки следующих рядов заполнить исследуемыми образцами.
Контрольную сыворотку крови человека неразведенную и в разведениях и анализируемые образцы на пластинах для определения IgG и IgA вносить в лунки по 2 мкл, а на пластине для определения IgM – по 3 мкл.
Пластины поместить во влажную камеру и инкубировать в холодильнике при температуре (5±3) °С: пластины для определения IgG и IgA в течение 24 ч, пластину для определения IgM – 48 ч.
7.3.10. Учет результатов.
После инкубации в агаровом геле образуются кольца преципитации.
Во многих случаях измерять диаметры колец преципитации можно на влажном агаровом геле. Измерение проводить с помощью окулярного микрометра, который прикладывают к обратной стороне пластин.
Пластины также можно окрашивать. Для этого пластины поместить в кюветы, залить натрия хлорида раствором 0,9 % и выдержать в течение 16-18 ч для отмывания от непреципитировавших белков. Затем пластины с агаровым гелем накрыть фильтровальной бумагой, смоченной в натрия хлорида растворе 0,9 %, и высушить на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку.
С высушенных пластин снять фильтровальную бумагу и поместить в кюветы с красящим раствором на 30-40 мин. Затем отмыть в растворе для отмывки агара после окрашивания в течение 5-10 мин и снова высушить.
На высушенных пластинах измерять диаметры колец преципитации с помощью специальной линейки (например, линейки «Берингверке») с точностью до 0,1 мм. По результатам измерения диаметров колец преципитации проводить вычисления концентраций иммуноглобулинов в исследуемых образцах.
Для этого на полулогарифмической бумаге (марка ПЛН, ГОСТ 334-73) построить систему координат: по оси абсцисс откладывать диаметры колец преципитации (в мм), а по оси ординат – концентрации иммуноглобулина (в МЕ/мл). Образовавшиеся точки соединить прямой линией. Таким образом построить графики для каждого иммуноглобулина в отдельности. Во избежание ошибок наклон этой кривой желательно иметь 40°-50°.
Для определения уровня иммуноглобулинов в исследуемом образце необходимо:
– на оси абсцисс отметить точку, соответствующую значению диаметра кольца преципитации исследуемой сыворотки;
– от полученной точки провести перпендикуляр до пересечения с кривой;
– точку пересечения спроецировать на ось ординат.
Полученное значение на оси ординат соответствует уровню иммуноглобулина в исследуемом образце, выраженном в МЕ/мл.
В случае, когда диаметр кольца преципитации исследуемого образца превышает значение диаметра кольца преципитации в неразведенной контрольной сыворотке крови человека, образец следует развести натрия хлорида раствором 0,9 % и повторить определение. Полученный результат умножить на величину разведения.
Концентрации для каждого иммуноглобулина можно вычислять и в весовых (мг/мл) единицах. Одна МЕ по международному референс-препарату иммуноглобу-линов для IgG соответствует 0,0804 мг, для IgA – 0,0142 мг, для IgM – 0,00847 мг.
Примечание: Описанные построения и вычисления можно производить с помощью компьютерной программы Microsoft Excel.
Средние значения показателей сывороточных иммуноглобулинов в норме:
IgG – 8-12 г/л;
IgA – 1,4-4,2 г/л;
IgM – 0,5-1,9 г/л.
Потенциальный риск применения набора – класс 1.
Все компоненты набора нетоксичны. Контрольная сыворотка крови человека не содержит HBsAg, антител к вирусу гепатита «C» (анти-ВГС) и антител к вирусу иммунодефицита (ВИЧ 1,2). Анализируемые образцы могут быть потенциально опасны. Поэтому при работе следует использовать средства индивидуальной защиты, а образцы и использованные материалы после проведения анализа обеззараживать раствором перекиси водорода 6 % или раствором хлорамина Б 3 % в течение 2 ч.
Работать, соблюдая требования в соответствии с ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (для бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и лечебно-профилактических учреждений).
